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本试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒，具有本底低、灵敏度高、线性范围宽、使用方便等特点。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/mL。

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
   
2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
   
3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。
   
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 装载探针
   对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
   
   1. 原位装载探针：原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。
      
   2. 收集细胞后装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
      加药刺激：直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。
      说明：仅在阳性对照孔中加入阳性刺激物作为阳性对照，其余孔不必加入阳性刺激物。阳性对照可以按照1:1000的比例使用。
2. 检测
   对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
   
3. 参数设置
   使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
   
4. 其它说明
   阳性对照可以按照1:1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
   另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。
   活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。